Величественный пятикупольный Успенский собор (1559-1585) был заложен по велению царя Иоанна IV Грозного в центре Лавры, на предварительно освобожденном от старых деревянных келий месте. Государь со всем семейством присутствовал при закладке храма. Его строительство стало продолжением традиции возведения в честь Успения Пресвятой Богородицы главных соборов древних русских городов. Освящение храма состоялось в 1585 году уже после смерти царя Иоанна Васильевича, совершил его митрополит Московский и всея Руси Дионисий в присутствии сына Иоанна Грозного Федора Иоанновича и его супруги Ирины.
Образцом для нового собора главного монастыря России стал Успенский собор Московского Кремля. Монастырский собор повторяет общую композицию пятиглавого и пятиапсидного храма, превышая по размерам столичный образец. Характерным украшением гладких стен собора является аркатурно-колончатый пояс, типичный для владимиро-суздальского зодчества и вновь использованный в качестве декоративного приема при строительстве Успенского собора Московского Кремля.
Массивность конструкций и более простой рисунок деталей отличают монастырский собор от столичного храма, возведенного итальянским зодчим Аристотелем Фиораванти. С западной стороны к собору примыкала открытая паперть, которую в XVIII в. заменили на крыльцо (1781), расписанное по указанию митрополита Платона (Левшина).
Богослужение в Успенском соборе Троице-Сергиевской лавры, Сергиев Посад
Внутреннее пространство Успенского собора поражает величественными размерами и насыщенностью светом. Шесть массивных пилонов размером 3×3 м держат высоко поставленные крестовые своды с пятью глубокими барабанами, оконные проемы которых излучают мощный световой поток. Строители монастырского храма не стали воспроизводить форму цилиндрических столбов кремлевского образца, а вернулись к традиционным русским опорам — пилонам прямоугольного сечения.
При главном алтаре устроены два придела: великомученика Феодора Стратилата и мученицы Ирины — в честь небесных покровителей царя Федора Иоанновича и его жены царицы Ирины Федоровны Годуновой. Возникновение еще одного придела — святителя Николая Чудотворца — относится к 1608-1610 гг., времени героической 1б-месячной защиты монастыря от польско-литовских войск.
В соборе с «полуденной» (южной) стороны в стеклянном саркофаге хранится главная святыня собора — деревянный гроб, в котором вплоть до 1585 года покоились мощи преподобного Сергия Радонежского. В 1585 году гроб был перенесен из Троицкого собора в Успенский, мощи же Преподобного в Троицком соборе были переложены в серебряную золоченую раку, выполнение которой было завершено при царе Федоре Иоанновиче.
Собор был расписан фресками за три с небольшим летних месяца 1684 г. ярославскими и троицкими мастерами под руководством одного из известных иконописцев того времени Дмитрия Григорьевича Плеханова. Стенопись Успенского собора выполнена в лучших традициях фресковой живописи XVII столетия и представляет собой целостный и яркий комплекс.
По-видимому, одновременно с фресками был создан резной золоченый пятиярусный иконостас, включающий в настоящее время 76 икон. Большинство икон в иконостасе относится к концу XVII в. Иконы неоднократно поновлялись и находятся под записью XIX в.
Внутри собора сохранились два бронзовых литых и чеканных паникадила XVII в. работы мастеров московской Оружейной палаты, подаренные в монастырь представителями рода Яновых.
У западной стены собора, по обеим сторонам главного входа, стоят 5 каменных надгробий, под которыми покоятся: супруга короля Левонии Магнуса королева Мария Старицкая (в монашестве Марфа, +1614 г.) — дочь удельного князя Владимира Андреевича Старицкого; ее дочь королевна Евдокия (+ 1589 г.), архиепископ Рязанский Моисей (+ 1651 г.), духовник царя Михаила Федоровича Романова и одного из ктиторов собора, архиепископ Московский Августин (Виноградский, +1819 г.), митрополит Московский Макарий (Булгаков, + 1882 г.).
В соборе также покоятся мощи святителя Иннокентия, митрополита Московского (1879 г.).